可調焦距透鏡實現三維顯微鏡

可調焦距的透鏡可加速和增強多種現代顯微鏡方法（包括共聚焦、雙光子和光片顯微鏡）的三維成像能力。

顯微鏡初學者可能會感到困惑，因為他們注意到樣本中僅略微失焦的部分在圖像中看起來往往要模糊得多。人眼看到的景深似乎比相機看到的景深大得多。這種令人困惑的效果之所以發生，是因為眼睛會適應：通過顯微鏡觀察時，用戶會不斷（通常是無意識地）移動焦平面，而無需觸摸調焦旋鈕，只需將目鏡調整到不同的焦距即可。因此，自從顯微鏡發明以來，可調透鏡就幫助研究人員更直觀地感受到微觀物體的三維形狀和紋理。在具有電子圖像采集功能的現代顯微鏡中實現類似的裝置是非常可取的。如今，科學家越來越需要在越來越短的時間尺度上以高空間分辨率對生物體的結構和功能進行成像。現代生物顯微鏡也正慢慢從對載玻片和蓋玻片之間的扁平小樣本進行成像轉向 3D 細胞培養、整個胚胎甚至動物體內成像，以研究更自然的環境中的發展和生理學。

傳統上，獲取 3D 圖像數據需要使用載物臺或壓電物鏡 Z 掃描儀對物鏡或樣本進行機械平移。由于此類設備中活動部件的機械慣性，要實現數百微米 Z 范圍 10 到 20 Hz 以上的體積掃描速率非常具有挑戰性。

另一種稱為“遠程聚焦”的解決方案涉及改變光進入或離開顯微鏡物鏡時的會聚度，以分別引起激發或發射焦點的軸向偏移。所有類型的可調光學元件都可以用于此目的：例如空間光調制器、可變形鏡和可調焦距透鏡。可調焦距透鏡成本低、結構和控制簡單、焦距調節范圍廣，特別適合要求以中等分辨率進行快速體積采樣的顯微鏡應用。

可調焦距透鏡技術

Optotune 的可變焦透鏡采用彈性聚合物材料。透鏡的核心元件由一個薄膜組成，該薄膜在充滿液體的腔室和空氣之間建立界面（圖 1）。為了調整焦距，音圈致動器對圍繞透鏡通光孔徑的液體容器施加壓力。因此，液體被迫進入透鏡的中心，從而改變膜的曲率。控制電可調透鏡 (ETL) 很簡單，只需要一個現成的電流控制器或透鏡驅動器為透鏡提供 0 至 290 mA 之間的電流。

圖 1. ( a、b )：電動可調鏡頭 (ETL) 的工作原理。電流控制的電磁或機械致動器向下推充滿液體的鏡頭容器，迫使鏡頭液體進入鏡頭中心并改變其形狀。( c ) 對于 ETL，我們提供了一個軟件控制的鏡頭驅動器 ( d )，用于提供電流。( e ) ETL 的典型響應時間約為 5 毫秒。實際穩定時間隨鏡頭光圈而變化。

有各種各樣的 ETL 可供選擇，其光圈范圍從 6mm到 16mm。對于高色散鏡頭液體版本，典型的焦距范圍為 52 至 120 mm，而對于低色散鏡頭液體版本，典型的焦距范圍為 80 至 200mm。在工作過程中，控制電流會使鏡頭升溫，導致溫度相關的焦點漂移。由于液體鏡頭的熱焦距膨脹比玻璃鏡頭的熱焦距膨脹大約大兩個數量級，因此鏡頭需要集成溫度傳感器。結合靠近液體的溫度傳感器以及鏡頭上校準曲線的存儲，USB 驅動程序固件可以計算出正確的電流值，以設置和維持鏡頭在給定的焦距。ETL的一大優勢是響應時間短，只有幾毫秒。圖 1e 顯示了響應矩形階躍脈沖時歸一化屈光度隨時間變化的典型示例。可調透鏡在 240 至 2500 nm 范圍內具有較大的透射率和較高的損傷閾值（1064 nm 連續波操作下的損傷閾值為 10 kW/cm2），并且具有保偏功能。

將可調透鏡集成到顯微鏡中

現代顯微鏡使用無限遠校正物鏡，這意味著源自樣品的光會以平行光束的形式從物鏡中射出。要創建圖像，需要一個額外的筒鏡（圖 2）。相反，通過將準直激光束發送到物鏡中，激光會集中到樣品內部的焦點上。使用可調透鏡改變光束的準直狀態會移動焦平面。例如，當將發散光束發送到物鏡時，焦點會移離其前透鏡。

圖 2. ( a ) 在具有無限遠校正光學系統的顯微鏡中，圖像由物鏡和筒鏡形成。( b ) 通過在物鏡和筒鏡之間插入由兩個消色差透鏡組成的附加中繼系統，形成共軛光瞳。ETL 和偏置透鏡可以放置在此位置以進行軸向聚焦，而無需改變數值孔徑或放大倍數。水平放置 ETL 和偏置透鏡可避免重力引起的透鏡膜變形。

對于大多數 3D 顯微鏡應用，需要能夠增加和減少物鏡的工作距離。一些 ETL 僅限于在正焦距極限之間進行調整。在這種情況下，需要將它們與固定負偏移透鏡 (OL) 配對，以將光束從會聚變為發散。當通過顯微鏡的目鏡觀察時，人類觀察者會移動頭部，直到他們的眼睛位于顯微鏡的出瞳處，通常可見為似乎懸停在目鏡上方的小亮盤。當放置在出瞳處時，眼睛可以最好地概覽微觀圖像，并且作為“集成”的人類聚焦裝置發揮最佳作用。理想情況下，ETL/OL 組合也放置在這樣的瞳孔位置，但使用標準目鏡的出瞳通常沒有好處：典型的筒透鏡和目鏡組合的高中置放大倍數極大地限制了可用的聚焦范圍。這是因為調整范圍與顯微鏡放大倍數的平方成反比。更好的選擇是使用定制的中繼系統創建與顯微鏡物鏡共軛的瞳孔位置（圖 2）。需要小心地將 ETL/OL 組件放置在光路的垂直部分（圖 2b）。否則，由于重力引起的透鏡膜變形，圖像可能會出現不必要的像差（尤其是彗形像差）。在具有高度模塊化設計的新一代研究顯微鏡中，集成這種中繼系統通常很簡單。盡管如此，一些商用儀器不應該由用戶進行大量修改。在這種情況下，ETL/OL 組合可以放置在平行光束路徑上的其他位置。缺點是將可調元件放置在遠離共軛瞳孔的位置會導致聚焦時放大倍數和數值孔徑 (NA) 發生變化。用光學設計術語來說，該系統不再是遠心的。因此，焦距偏移伴隨著變焦效果和分辨率變化。對于小的調諧范圍 - 幾十分之一微米 - 這些影響通常非常小且可以容忍。對于較大的焦點位移，可以通過圖像處理來補償放大倍數的變化。

圖 3.使用 40 倍物鏡和集成在轉盤共聚焦顯微鏡中的 ETL 拍攝的花粉粒（直徑 100 μm）的 Z 軸堆疊圖。圖中顯示了不同軸向焦點位置的單幀圖像和最大強度投影。最大 Z 軸范圍為 60μm。

在遠程聚焦系統的設計中，成本和復雜性之間存在著重要的權衡。與可變形鏡或空間光調制器不同，大多數可調透鏡只有一個自由度，即焦距。在遠程聚焦路徑中配備單個 ETL 的顯微鏡無法像真正的自適應光學顯微鏡那樣在 Z 調諧范圍內執行同樣復雜的像差校正。但是，使用 ETL 聚焦的成本僅為成熟自適應光學裝置成本的一小部分。

應用示例：共聚焦顯微鏡

共聚焦顯微鏡是最重要的顯微鏡技術之一，它在細胞生物學、單分子物理學和許多其他學科中有著廣泛的應用。我們測試了 ETL 與連接到倒置顯微鏡支架（Olympus IX71）的商用轉盤共聚焦顯微鏡模塊（Yokogawa CSU-X1）的組合。

由于無法在該顯微鏡中集成中繼系統，因此將 ETL/OL 組件安裝在可旋轉到光路中的定制濾光塊中。使用 40 倍物鏡和 1.3 NA（Olympus UPLFLN 40XO），最大 Z 范圍達到 60 μm。

應用示例：體內雙光子顯微鏡

由于在散射介質中具有出色的成像能力，雙光子激發是一種非常適合對腦組織深處進行熒光成像的技術。結合神經元活動的功能指標和體內成像協議，雙光子顯微鏡是一種標準方法，用于記錄活體小鼠腦內數百微米深處的十分之一到數百個神經元的群體活動。

對單個焦平面的采樣只能提供局部網絡中分布活動模式的一瞥。因此，我們修改了現有的雙光子顯微鏡，該顯微鏡能夠使用帶有 ETL 和 OL 的聲光偏轉器進行非常快速的 X/Y 掃描。1聲光偏轉器可以以千赫茲的速率以隨機訪問模式快速將飛秒激光束瞄準大量神經元。

添加 ETL 可以快速瞄準多個焦平面。我們實現了 30 到 40 Hz 的成像速率，最多可對 40 個神經元進行成像，這些神經元分布在相距 30 到 100 μm 的兩個平面上（圖 4）。除了多平面成像外，ETL 還可用于對清醒和行為動物進行運動校正。

圖 4. ( a ) 物鏡支架，用于將 ETL 集成到帶有聲光偏轉器的定制雙光子顯微鏡中，以便對小鼠大腦中的神經元活動進行體內成像。ETL 由電流控制器 (CC) 驅動，并與偏置透鏡（未顯示）組合安裝在靠近物鏡的位置。( b ) 由于 ETL 未放置在共軛瞳孔位置，因此掃描體積呈錐形。聲光偏轉顯微鏡可以使用鈣指示劑以隨機訪問掃描模式快速測量神經元活動。ETL 增加了以高達 40 Hz 的速率對多個平面進行成像的能力。( c ) 這些圖像顯示了不同深度的兩個平面（神經元顯示為灰色，星形膠質細胞顯示為橙色）。選擇用于快速鈣成像的細胞（1 到 40）已標記。神經元信號表現出對施加在動物胡須上的重復氣流的刺激鎖定反應。比例尺：20 μm。

應用示例：快速3D光片顯微鏡

在過去十年中，光片顯微鏡和選擇性平面照明顯微鏡 (SPIM) 已被公認為生物樣本體內成像的理想工具（例如，用于記錄斑馬魚和果蠅的胚胎發育）。在 SPIM 中，樣品從側面用光片照射，以將熒光激發限制在顯微鏡物鏡焦點的單個平面上。SPIM 提供出色的光學切片、低光毒性和高圖像采集速度，并被《自然方法》評為 2014年度方法。

圖 5.使用配備 ETL 的快速 Z 掃描 (ETL-SPIM) 光片顯微鏡以 60 Hz 體積速率對跳動的斑馬魚心臟進行 3D 重建。心臟標記為藍色；紅細胞顯示為紅色。

最近，SPIM 裝置配備了 ETL，可進行快速體積掃描。使用以每秒數百到數千幀的速度運行的相機，可以以每秒 30 到 60 次體積掃描的空前速度獲取跳動斑馬魚心臟內的 10 到 20 個平面。4如此高的體積率可以追蹤流經跳動心臟的單個紅細胞。

未來

未來，將提供具有更大通光孔徑和調諧范圍的 ETL，以及可使重復性提高一個數量級的創新驅動電子設備。還可以想象，帶有集成可調鏡頭的顯微鏡物鏡將在未來十年內投入常規使用。

認識作者

Fabian F. Voigt 是瑞士蘇黎世大學腦研究所的博士生

致謝

作者感謝 Manuel Aschwanden、Jerry Chen、Adriana Dabacan、Helge Ewers、Florian Fahrbach、Benjamin Grewe、Fritjof Helmchen、Jan Huisken、Michaela Mickoleit、Oliver Pf?ffli 和 Mark Ventura 為實現基于 ETL 的快速 3-D 顯微鏡所做的貢獻。

參考文獻

1. B. Grewe 等人 (2011)。使用電動可調焦距透鏡對神經元細胞群進行快速雙層雙光子成像。Biomed Opt Express，第 2035-2043 頁。

2. J. Chen 等人 (2013)。使用可調焦透鏡進行雙光子成像期間在線校正舔舐引起的大腦運動。J Physiol，第 4689-4698 頁。

3. EHK Stelzer (2015)。用于定量生物學的光片熒光顯微鏡。Nat Methods，第 12 卷，第 1 期，第 23-26 頁。4

4. F. Fahrbach 等人（2013 年）。帶可調透鏡的快速 3-D 光片顯微鏡。Opt Express，第 21010-21026 頁。5

5. M. Mickoleit 等人（2014 年）。高分辨率重建跳動的斑馬魚心臟。Nat Methods，第 11 卷，第 9 期，第 919-922 頁。