用于寬視場、共焦、雙光子和檢測顯微鏡的可調焦距鏡頭

概述

可調焦距鏡頭EL-10-30 具有大光圈、快速響應和啟動時間以及良好的光學質量等特點，為顯微鏡的各種應用提供了廣闊的前景。在本應用說明中，我們討論了電動可調透鏡 (ETL) 在三種不同顯微鏡方法中用于快速軸向聚焦的實施情況：(1) 經典寬場熒光顯微鏡，(2) 熒光共聚焦顯微鏡和 (3) 雙光子顯微鏡。

一般考慮因素和典型應用

電動可調焦距透鏡可用于顯微鏡的不同應用。其中包括專門的可調照明系統以及電控變焦光學系統等。在本應用說明中，我們只討論電動可調焦距透鏡在沿光軸聚焦方面的應用。根據電動可調焦距透鏡的實現方式和光學性能要求，可以實現30-700μm的軸向聚焦范圍。不過，在顯微鏡中使用電動可調透鏡所討論的大多數技術細節也適用于其他應用。在標準顯微鏡中，軸向聚焦通常是通過移動 Z 平臺上的試樣或顯微鏡物鏡來實現的。精確聚焦的常見替代解決方案是使用壓電驅動物鏡支架。然而，這些聚焦技術都是基于相對于標本的機械軸向移動。如果使用光學聚焦方案，則可以實現無運動、甚至更快的聚焦。 在顯微鏡的光學通路中加入電動可調焦距透鏡是實現光學聚焦的便捷解決方案。現代顯微鏡物鏡采用無窮遠校正光學系統，這意味著從物鏡焦平面內某一點發出的光不會聚焦到像平面內的某一點，而是作為一束平行光束（聚焦到無窮遠）從物鏡中射出（圖 1）。要在檢測器上形成真實圖像，還需要額外的管狀透鏡。

圖 1：無限遠校正物鏡在成像過程中將平行光束聚焦到焦平面上的光點，反之亦然。 位于標稱焦平面下方或上方的點光源會分別產生會聚光束或發散光束。

如果將物體或光源移近物鏡前透鏡，物鏡會產生發散光束，而將物體放置在比標稱工作距離更遠的地方則會產生會聚光束。這些條件也可以反過來考慮： 如果可以使用可調光學元件在物鏡上產生發散光束或會聚光束，顯微鏡就可以沿光軸聚焦。這既適用于照明，也適用于通過物鏡的成像光路，如激光掃描顯微鏡。

由于液態鏡頭EL-10-30 只能產生可調諧的會聚光束，因此必須搭配負焦距的偏置透鏡，才能實現從負焦距到正焦距的調諧范圍（圖 2）。我們將焦距為 -100mm的平凹單透鏡與 液態鏡頭EL-10-30（低色散變體，焦距范圍為50-200mm）組合在一起。電動可調焦距透鏡和偏置透鏡 (OL) 的組合可安裝在定制透鏡架或標準 30 mm透鏡管中。

圖 2：EL-10-30 (電動可調透鏡) 和負焦距偏置透鏡 (OL) 的 ZEMAX 模型（f= 100mm，Thorlabs LC4232）。請注意可調表面曲率的變化以及由此產生的光束發散變化。

實現光學聚焦的最簡單方法是將 ETL/OL 組件盡可能靠近物鏡安裝（圖 3）。例如，可以將 ETL 和 OL 安裝在帶有兩個有效值螺紋的鏡筒中，并插入物鏡轉舌器和物鏡之間，這與插入壓電聚焦裝置的方式相同。

圖 3：ETL/OL組件與顯微鏡物鏡相結合（USP 4231637）。整個系統的軸向長度約為50mm。在該系統中，EL-10-30的焦距從150mm移動到80mm，會導致軸向焦距在標稱工作距離周圍發生-50 μm到 +50μm的移動。物鏡焦距為4.4 mm。

將 ETL 和 OL 放置在靠近物鏡后擋板的位置既直接又簡單，但這并不是光學聚焦的最佳位置，也不適合所有成像應用。大多數顯微鏡物鏡都是遠心的，這意味著每束射線中的中心射線（如圖 3 中紅色的軸上射線），也稱為主射線，在離開物鏡前透鏡后沿光軸傳播。將 ETL 放在靠近物鏡的位置進行聚焦會導致非遠心條件（圖 4）。其結果是，如果軸向聚焦位置發生變化，視場（FOV）大小或放大倍率也會發生變化。如果所需的焦點偏移很小（< 50μm），則可以忍受。另外，ETL/OL 組件也可以通過 4f 中繼系統（例如由兩個消色差組成的 4f 系統）定位在顯微物鏡的共軛瞳孔平面上，因為大多數物鏡都有一個無法觸及的擋板（圖 5）。

圖 4：顯微鏡物鏡前透鏡上的兩條射線束在樣品的不同側向點聚焦。左圖顯示了遠心條件下的兩條射線束--中央綠色（主射線）平行于光軸傳播（藍色主射線）。中間和右圖顯示的是使用同一物鏡聚焦，ETL/OL 靠近其后擋板的情況。斜（紅色）射線束的主射線并不平行于光軸傳播，因此，如果焦平面移動到更靠近物鏡的位置（導致放大倍率或 FOV 大小改變），紅色和藍色焦點之間的距離就會增加。

圖 5：保持遠心成像條件的 4f 中繼系統布局示例。ETL/OL 組件（左側）通過中間部分由兩個 f=100mm消色差組成的 4f 系統放置在物鏡（日本專利 8-292374；右側）的共軛瞳孔平面上。瞳孔（紅光束和藍光束的交點）被重新成像到物鏡中。該系統的總長度約為 380 mm。要生成圖像，系統左側需要一個管狀透鏡。在基于 ETL 的聚焦過程中，中間焦平面會發生移動。

不過，大多數商用顯微鏡不允許將中繼系統插入光路。在這種情況下，將中繼系統置于相機或激光端口可能是一種選擇。

電動可調焦距鏡頭EL-10-30 的控制方式

通過使用激光二極管的精密恒流驅動器（例如 Edmund Optics NT56-804、Thorlabs LD1255R）和 0-250 mA可編程模擬輸出，可以輕松實現對 EL-10-30 的計算機控制。對于簡單的聚焦應用，只需將控制電流與聚焦位置相關聯的校準查找表即可（請參見圖 15）。

兩種實施方式概述如下：

應用實例： 寬視場顯微鏡

就視覺使用而言，聚焦時視場角或放大倍率的變化會造成混淆（因為其視覺外觀相當于變焦效果）。如果對焦增量較小（幾微米），這種情況還可以忍受，否則就會造成干擾。在這種情況下，有必要將 ETL/OL 組件置于共軛瞳孔位置。在大多數顯微鏡中，必須在光路中插入一個定制模塊，其中包含附加的中繼光學元件和 ETL/OL 組件。在典型的直立式顯微鏡中，停止位置位于物鏡內部，無法觸及，因此必須使用中繼系統。然而，在倒置顯微鏡中，顯微鏡機身內部的光學元件通常會形成一個共軛瞳孔，在某些類型的顯微鏡中，這個瞳孔是可觸及的，并且位于光路的垂直部分，因此非常適合插入基于 ETL 的聚焦系統。20 世紀 80 年代的蔡司 Axiovert 35 就是這樣一款顯微鏡，如圖 6 所示。

安裝

通過將 ETL/OL 組件插入 30 mm的鏡筒，并將其固定在光學導軌上（圖 8），使其靠近瞳孔。為了定位瞳孔位置，可以使用一個簡單的技巧： 將用于相位顯微鏡的相位掩膜重新成像到共軛瞳孔平面。在聚光鏡或物鏡中形成相位掩膜清晰圖像的位置就是 ETL 的理想位置（圖 8 中的插圖）。這種基于 ETL 的聚焦方式還有一個優點，即 ETL 可用于多種物鏡。根據物鏡的不同，ETL 和 OL 的最佳位置可能會有所偏移，因為某些類型的物鏡在瞳孔成像特性上有所不同。

圖 6：Axiovert 35 顯微鏡的光路。ETL/OL 組件可放置在瞳孔處，無需插入額外的中繼系統。TL：管狀透鏡。

圖 7：Axiovert 35 顯微鏡，取下側蓋可進入瞳孔。圖 6 中顯示的部分光學元件突出顯示。

圖 8：在共軛瞳孔位置插入 ETL/OL 組件。ETL 和 OL 安裝在連接到光學導軌的支柱上。插圖： 共軛瞳孔位置可通過尋找相位環的清晰圖像來確定。

結果

結合使用 40x NA 0.6 物鏡（Zeiss LD Achroplan 40x / 0.6 Korr Ph2），可實現最大 120μm的散焦范圍（校正環設置在固定位置）。圖 9 顯示了用 ETL 聚焦采集到的一組花粉粒的 Z 疊圖像示例（表熒光模式）。

圖 9：通過一組花粉粒進行基于 ETL 的聚焦。相對于標稱圖像平面，圖像范圍從 -30μm到 + 25μm。由于 ETL 位于共軛瞳孔處，因此放大倍數沒有變化。比例尺：100μm。

應用示例 共聚焦顯微鏡

共聚焦顯微技術是最重要的顯微技術之一，在細胞生物學、單分子物理學和許多其他領域有著廣泛的應
用。

安裝

標準共聚焦顯微鏡是高度集成的系統，無法訪問或插入光路中的大部分光學元件。根據具體的顯微鏡，可以采用不同的解決方案插入 ETL/OL 組件。一種方法是，如果共焦成像不需要濾光器立方體，則將 ETL/OL 組件安裝在顯微鏡支架濾光器轉塔中的定制濾光器立方體中。另外，也可以將 ETL 安裝在中繼系統中（圖 10）。

我們使用的顯微鏡1（圖 11）是一臺旋轉盤共焦儀，共焦單元（橫河 CSU X1）和 CCD 攝像機連接到奧林巴斯 IX-71 的側端口。這種顯微鏡配置允許將包含 ETL 和 OL 的改裝原始濾光片盒插入濾光片轉塔，而無需對顯微鏡進行大量改裝。在操作過程中，只需將濾光片轉塔旋轉到空位，即可將 ETL 從光路中移除。

圖 10：在典型的倒置激光掃描顯微鏡中實現基于 ETL 的聚焦的三種不同方案。(1) ETL/OL 可以像壓電式聚焦裝置一樣放置在顯微鏡物鏡和物鏡轉塔之間。(2) 如果可能，可將 ETL 和 OL安裝在定制的濾光片立方體中。這兩種方法都有一個共同的缺點，即在聚焦過程中放大倍率可能會發生顯著變化。(3) 為了避免這種情況，可以在共焦掃描裝置和顯微鏡支架之間插入一個中繼系統。為使系統達到最佳性能，ETL 應位于光路的垂直部分，否則，由重力引起的可調諧膜的不對稱變形可能會導致圖像質量下降。

圖 11：在共聚焦顯微鏡中實現 ETL 和 OL。(a) 旋轉盤裝置安裝在顯微鏡支架的左側端口。藍色 CCD 相機用于成像。驅動 ETL 的電流轉換器由函數發生器控制。ETL/OL 組件安裝在定制的濾光器立方體 (b) 中，并插入濾光器轉塔 (c)。濾鏡轉塔重新插入顯微鏡支架，就在物鏡轉塔的下方。

結果

結合使用 40x NA 1.3 物鏡（奧林巴斯 UPLFLN 40XO），可以實現 60μm的 z 范圍。圖 12 顯示了花粉粒（直徑 100 μm）z-stack 的單張切片。

圖 12：花粉粒（直徑 100μm）的 Z 疊圖，范圍為 60μm。圖中標出了相對于第一幅圖像的 Z 位置。比例尺： 50μm。

圖 13：圖 9 所示數據的最大強度投影。

應用實例： 雙光子顯微鏡

雙光子激發技術在散射介質中具有出色的成像能力，因此非常適合在組織深處進行熒光成像。結合神經元活動的功能指標和活體成像方案，雙光子顯微鏡是記錄活體小鼠大腦深處十分之一到數百個神經元群體活動的標準方法。神經元分布在整個體積中，對單個焦平面進行取樣只能提供局部網絡中整個活動的提示。因此，我們需要快速、簡單的三維顯微鏡技術，而 ETLs 的使用提供了一種非常簡單直接的方法。事實上，ETLs和雙光子顯微鏡是一種理想的組合，主要體現在以下幾個方面：

• 在大多數雙光子顯微鏡中，只需在激發路徑上實施光學聚焦方案即可實現軸向掃描。這是由于雙光子顯微鏡采用了非線性激發過程，只能在焦點處激發熒光團。通過改變激發光束來沿軸向和橫向移動焦點，就足以實現三維雙光子激光掃描顯微鏡。

• 激發激光的波長為近紅外波長，在我們的顯微鏡中為 850nm。長波長可容忍在可見光波長下會嚴重降低圖像質量的波前像差。

• 激發激光的光譜帶寬較小（10 nm FWHM），這限制了非色差 ETL/OL 組合可能帶來的色差影響。

• 對于大多數測量功能細胞活動的生物應用而言，安裝在物鏡附近的 ETL/OL 組件所帶來的視場尺寸變化不會干擾測量。要記錄功能數據，激光必須在一段時間內反復對準同一組細胞。如果由于放大倍率的變化，細胞之間的距離變遠，則會選擇相應的點進行掃描。

安裝

與定制的雙光子顯微鏡結合使用的裝置如圖 14 所示。

圖 14：ETL/OL 組件在雙光子顯微鏡中的應用。(a) ETL 和 OL 安裝在一個定制的物鏡架上，物鏡架連接到顯微鏡的檢測系統上。利用可移動的二色性 DC，可將發射的熒光引導至背景中的檢測系統。物鏡架底部有一個 RMS 螺紋，可安裝奧林巴斯 LUMPlanFl/IR 40x NA 0.8 水浸物鏡。(b) 安裝在定制支架內的 ETL 和 OL的剖面圖。(c) 直接觀察熒光素溶液中的雙光子激發焦點。結合 40 倍物鏡，焦點（綠色細長光斑）的移動范圍可達 700 μm。

結果

通過在 50 至 200mm之間調整 ETL 的焦距，可以實現高達 700μm的軸向聚焦。物鏡的工作距離（名義上為 3.3 mm）相應地從 2.8mm變為 3.41mm。對于大多數成像應用來說，更小的范圍就足夠了。

圖 15：軸向焦距偏移（40 倍物鏡，-100mm偏置透鏡）與 ETL 控制電流的關系。這組校準值被用作查找表，以便對焦到所需位置。

圖 16：用顯微鏡電動 Z 平臺測量的花粉粒在不同軸向焦距位移下未經 ETL 重新聚焦（左圖）和經 ETL 重新聚焦后的圖像。請注意放大倍率/視場大小的變化。刻度線： 5μm。

應用實例： 檢測顯微鏡

在使用標準鏡頭組件的檢測顯微鏡中，可調諧鏡頭通常位于無窮遠校正物鏡和管狀鏡頭之間。下面的示例概述了將 EL-10-30-Ci 與 Qioptiq 的 Optem 微型檢測鏡頭相結合的現成系統。所有部件都有 C 型安裝螺紋，因此可以完美配合。下表概述了實現的 Z 范圍和分辨率。

圖 17：使用現成組件的高倍率檢測系統示例。圖中顯示的是放大 7.9 倍的印刷電路板（軌跡寬度為 10μm）

在顯微鏡中使用電動可調透鏡

• 在光束路徑的哪個位置插入 ETL/OL 組件？是否可以到達這個位置？

• 是否可以將 ETL/OL 組件垂直放置在光路內的地面上，以避免電動可調透鏡表面因重力而出現任何不對稱形狀？

• 光束是否足夠小，以匹配 EL-10-30 的 10mm孔徑？（這也適用于共軛瞳孔的大小。）如果不需要電動聚焦，請考慮使用手動可調鏡頭 ML-20-35，其自由孔徑為 20mm。

• 您需要達到哪個聚焦范圍？在大多數情況下，使用電動可調透鏡的光學聚焦需要輔以機械聚焦裝置，才能達到所需的范圍。電動可調透鏡非常適合使用中高 NA 物鏡實現從十分之一到數百微米的聚焦范圍。使用低倍率、低凈空系數（NA）物鏡，聚焦范圍似乎可以達到 1mm。

• 必須滿足哪些光學性能要求？例如，在雙光子顯微鏡中，準單色的近紅外激發光可以降低對色差和其他像差的校正要求，從而獲得數百微米的聚焦范圍，這正是活體大腦成像所需要的。另一面，典型的共聚焦顯微鏡在光學校正方面的要求要高得多，但典型的樣本尺寸也要小得多（十分之一微米），這使得 ETLs能夠成功應用于某些應用。對整個顯微鏡進行光學模擬，通常可以使電動可調透鏡介導的聚焦符合必要的要求。

• 目標對焦速度是多少？EL-10-30 的快速對焦已得到證實（使用 40x NA 0.8 物鏡，15ms內對焦移動100 μm，相當于焦距從 108 mm變為 82mm）。